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3D Select™-3D InSight™ マイクロティッシュの作製プロセス-

GravityPLUS™を使用したスフェロイド作製は簡便でかつ再現性の高い方法ですが、この方法を使用するだけでは一貫した結果を得ることはできません。

プラットフォームの他にも材料となる細胞の選別や最適化されたプロトコル、最適化された培地など、追加で必要となる様々な要素があります。

一貫した高品質な3D スフェロイド(マイクロティッシュ)の提供のために、InSphero社では原料となる細胞の融解、選別、前培養や共培養時の細胞組成調製、マイクロティッシュ作製、作製後のマイクロティッシュの品質管理や輸送など、様々な段階で独自の技術を保有しております。

これらの技術を統合することによってお客様の試験結果の確実性や再現性を高めるために有用なマイクロティッシュを提供することが可能になります。

図 1. マイクロティッシュの作製プロセス

高品質なスフェロイド作製

高品質な3D スフェロイド(マイクロティッシュ)の作製のために、InSphero社では原料となる細胞の融解、選別、前培養や共培養時の細胞組成調製から作製後のマイクロティッシュの品質管理等、様々な段階で独自の技術を保有しております。これらの技術を統合し、同社の特許申請中の技術3D Select™プロセスが構成されています。

3D Select™プロセスで重要となるのはマイクロティッシュの材料として正しい機能を保持し、活性が高い細胞のみを選別して使用することです。

ヒトや動物の凍結細胞や新鮮細胞、iPS細胞由来の細胞を使用する場合でも、死細胞や機能が低下した細胞を使用することによって自発的な凝集によるスフェロイド形成に負の影響を与え、細胞集団の性質の不均一化を招き、ネクローシスを起こした部位が発生します。

3D Select™プロセスを用いることによって凝集効率を最大化し、細胞の機能やバイアビリティを何週間も保つことが可能になります。これらの特徴は特に大規模なマイクロティッシュ作製で顕著に表れます。

3D Select™ を利用した肝臓マイクロティッシュの作製

3D Select™プロセスはマイクロティッシュ作製の成否のみでなく、構成する個々の細胞の状態を反映してマイクロティッシュとしての機能性やバイアビリティにも大きな影響を与えます。

以下のデータはヒト肝臓マイクロティッシュの作製に3D Select™プロセスを適用した場合とスフェロイド形成の従来法を適用した場合を比較した結果で、明確にこのプロセスの優位性を示しています。

3D Select™プロセスはまた非常に再現性が高く、連続した作製においても同一サイズのマイクロティッシュを大量に作製することが可能であり、長期にわたる試験や複数の施設での試験に対しても標準化されたマイクロティッシュをお届けできます。

スフェロイド形成の効率とバイアビリティ

図 2. 6人のドナー由来の凍結ヒト肝細胞(PHH)を使用した際の、スフェロイド形成の効率、バイアビリティ(マイクロティッシュの総ATP量)、形態の比較結果。

6人の異なるドナー由来PHHを用いてスフェロイド形成およびバイアビリティの指標としてのATP量が測定されました。全てのドナーで3D Select™を用いた場合に確実なスフェロイド形成と高いATP量が観測されました。ドナー6を除き、2つの方法で非常に大きな差異が観察されています。高いATP量はスフェロイド形成前に死細胞や機能性が低い細胞が除かれていることの結果と考えられます。

形態比較

図 3. 従来法および3D Select™を利用して作製されたマイクロティッシュの比較図。

どちらの場合でもドナー番号6および1由来の肝細胞は両方スフェロイドを形成できるように見られますが、従来法では形成後5日目ですでにスフェロイド中にネクローシスを起こしている部位(エオシン染色で濃ピンクに染色されている部位)が観測されます。3D Select™を利用した場合、細胞間の境界が明確であり、明瞭な核を持ち、立方体状の肝細胞特有の形状を示し、従来法と比較して形態に改善が見られます。

高い再現性

図 4. 同一ドナー由来の肝細胞を用いた24回のマイクロティッシュ作製(n=6)の結果

3D Select™プロセスはスフェロイド形成の効率や形態の改善に役立つだけでなく、異なったドナー由来の肝細胞ロットを使用した場合でも再現性良く大量にマイクロティッシュを作製することを可能にします。

全ての製造ロットで3DInSight™肝臓マイクロティッシュの諸元(直径200~350μm、直径平均のばらつきが10%以下)に合致しています。上記実験全体では平均直径は280μmであり、ばらつきは4.5%でした。

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